• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1984003512A1
    申请号:PCT/JP1984/000074
    申请日:1984-03-01
    公开日:1984-09-13
    发明作者:Tamotsu Minami；Nobumi Kusuhara；Mitsuo Onofusa；Tosihiro Sasaki
    申请人:Mitsui Toatsu Chemicals；
    IPC主号:C07H21-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] デォキシ リ ボ核酸の切断処理方法及び装置
    [0003] 技 術 分 野
    [0004] 本発明はデォキシ リ ボ核酸の塩基配列を化学的に決定 する方法に関 し、 詳 し く は放射性 リ ン で標識されたデォ キ シ リ ボ核酸を塩基選択的に化学試蔡で修飾 し、 その修 飾された塩基の位置でデォキシ リ ボ核酸鎖を切断するェ 程の う ち、 化学修飾反応の終った反応液から 化学修飾さ れたデ才キシ リ ボ核酸を取出 して、 それを修飾された塩 基の位置で切断する方法及びその方法を実施するための 装置に関する。
    [0005] 背 . 景 技 術
    [0006] 最近デォキ シ リ ボ核酸 （以下 DN Aと略称） の塩基配列 を直接に決定する方法がい く つか開発されているが、 な かでも マキサム とギルバ一 卜 によって開発された化学的 配列決定法は、 実験操作が比較的簡単なこ と、 迅速性お よび正確さの点で他の決定法に比べて遜色がないこ とな どの利点があるので広 く 用いられている。 この方法の詳 細は Proc. Acad. Sci. 、 第 7 4 巻、 5 6 0 頁、 1 9 7 7年 蛋 白質核酸酵素第 2 3 巻、 1 8 2 頁、 1 9 78年等に述べ られているが、 簡単に 言えば一端が放射性 リ ン で標識さ れた DNA試料を調製 し、 該 DNAを搆成する 4 種の塩基 (グァニ ン 、 アデニ ン 、 チ ミ ン 、 及びシ 卜 シ ン 、 以下そ れぞれ G .、 A , Τ 、 C と略称） を、 それぞれ選択的に化 学試薬で修飾し、 次にその修飾された塩基の位置で DN 鎖を切断し、 得られた 断片をゲル電気泳勣法によつ て 1 塩基種ずつその断片の分子鎖の長さの順に展開分離 し、 オ ー ト ラ ジオグラ フ ィ 一によ り X線フ ィ ル ム上にそ の展開分離されたバ ン ドを写 し出 し、 次いでこの X線フ イ ル ム上のパ ン ドに対 する塩基を同定する こ とによ り はじめの DNA試科の塩基配列を決定する とい う ものであ ο
    [0007] 上記の方法を大き く 工程別にわければ、 次の 4工程か ら成り立つている と言える。 即ち
    [0008] ① DNAの 3'または 5 '末端を放射性 リ ン で標識する工程
    [0009] ②標識 DNAを塩基選択的に化学修飾し、 且その位置で
    [0010] DNA鎖を切断する工程
    [0011] ③切断された DNA断片をゲル電気泳動法によって展開 し X線フ ィ ル ム上にバ ン ドを写し出す工程
    [0012] ④ X線フ ィ ル ム上のバ ン ドから塩基配列を読み取る工程 め ο
    [0013] このマキサム - ギル バ一 卜 法は前述の如き利点がある ため広 く 用いられているが、 上記各工程の操作は従来す ベて手作業によってなされているため、 多 く の DN Α試料 についてその塩基配列を決定する場合はその操作はきわ めて煩維であり 、 時間のかかる作業である 0 従って操作 の機械化.によ り作業の能率化をはかる こ とが望ま しい。 本発明は上記 4工程の う ちの第 2 工程即ち標識 D NAを 塩基選択的に化学修飾 し、 且その位置で DNA鎖を切断す る工程の操作を機械化 して作業の能率化を計るための方 法及び装置に関する。 従来の第 2 工程の操作は、 標識 D NAを含有する試料溶液を樹脂製のチュー ブ 4 本に分注 し、 その各々に、 4種の塩基即ち G 、 A 、 T 、 C にそれ ぞれ特異的な化学修飾 （試薬及び反応条件） を別々 に施 し、 エ タ ノ ー ルを加えて - 4 0 乃至 - 7 0 に冷却後遠 心分離 して上澄液を吸い取って捨て、 残った沈殿に再び ェ タ ノ 一 ルを加えて遠心分離 して上澄液を吸い取って捨 てる沈殿の洗浄操作を く り かえすこ とによって化学修飾 で使用 した過剰の試薬類を沈殿から除去し、 次いで沈殿 に切断用試-菜 （水酸化ナ 卜 リ ゥ ム または ピペ リ ジ ン） の 水溶液を加えて加熱する こ とによ り 修飾された塩基の位 置で DN A_鎖を切断 していた。 本発明者等は上記操作の う ち、 特にエ タ ノ ー ルを加えて冷却、 遠心分離する操作が
    [0014] I
    [0015] こ の工程を機械化する際の難点である と判断 し、 これを 解決するために種々検討 した結果、 遠心分離法に代えて 吸着法を採用 し得る こ とを見出 して本発明に到達 した。
    [0016] 発 明 の 開 示
    [0017] 本発明は D N Aの化学修飾反応の終った反応液から、 化 学修飾された D N Aを分離 し、 次いでそれに切断用試薬を
    [0018] 加えて加 ·熱する こ とによ り 修飾された塩基の位置で DNA 鎖を切断する DNAの切断処理方法において、 該分離操作 を、 化学修飾反応の終った反応液を吸着剤と接触させて 該吸着剤に化学修飾された D NAを吸着させ、 該吸着剤を 洗浄液で洗铮して付着している化学修飾試薬を除去した 後、 溶出液と接触させて吸着されていた化学修飾された DNAを溶出せしめ、 該溶出液を濃縮する こ とにより行な う こ とを特徵とする DNAの切断処理方法である。
    [0019] 本発明はまた上記方法を実施するための装置であり 、 その装置が該反応液を収容する反応器、 移液ボ ン ブ、 該 化学修飾された D N Aを吸着保持する 吸着器、 三方弁およ び濃縮器を含んでいて、 且これらが上記の順に输送管に よって相互に連結されている こ とを特徵とする DNAの切 断処理装置である。
    [0020] 上記した本発明の処理装置においては、 化学修飾を終 了 した溶液から DNAを吸着保持する吸着器、 該吸着 D NA を洗浄して化学修飾に使用 した試薬類を洗去する設備、 吸着 DNAを溶出する設備および溶出液を濃縮する設備を 用いて極めて簡単に且つ機械的に装置を操作する ことに よ り 、 前記した本発明の方法を実施する ことが出来る。
    [0021] 図 面 の 簡 単 な 説 明
    [0022] 第 1 図は本発明の装置の好ま しい実施態様の系統図の 1 例である。 第 2 図は本発明によって切断処理した D N A の電気泳.動ォ一 卜 ラ ジオグラ フの スケ ッ チの 1 例である。 発明を実施するための最良の形態
    [0023] 本発明の方法及び装置を更に詳 し く 説明するために、 その実施態様の一つを図面を参照 して述べる。 第 1 図の 反応器 1 中の反応容器 laに放射性 リ ン標識 DNAを入れ、 各種試薬を加えて所定温度、 所定時間化学修飾反応を行 なったのち、 移送ポ ン プ 4 を作動 して上記反応液を D N A 吸着器 2 に通過させる。 通過液は三方弁 5 を通って廃液 タ ン ク 6 に排出され、 化学修飾された： D N Aは吸着器 2 中 に充塡されている 吸着剤に吸着保持される。 二方弁 7 を 開いて洗浄液タ ン ク 8 から所定量の洗浄液を反応容器 la に注入し、 再び移液ポ ン プ 4 を作動 して移液ポ ン プ 4 、 DNA吸着器 2 および三方弁 5 を通って洗浄液を廃液タ ン ク 6 に流す事によ り 吸着器 2 中の吸着剤に付着 している 化学修飾試薬を洗浄除去する ο 次に二方弁 9 を開いて溶 出液タ シ ク 10 から所定量の溶出液を反応容器 laに注入 し、 三方弁 5 の液出 口の向きを濃縮器 3 側に切替えておいて 再び移液ボ ン ブ 4 を作動 して溶 液を移液ボ ン プ 4 、
    [0024] D N A吸着器 2 および三方弁 5 を通って濃縮容器 3aに導 く こ とによ り 吸着器 2 中の吸着剤に吸着保持されていた化 学修飾された D NAを溶出 して濃縮容器 3a中に導 く o
    [0025] 真空ポ ン プ 12および振動機 13を作動 し、 減圧調節弁 14 を開いて濃縮容器 3a内の溶出液を減圧濃縮する。 蒸発 し
    [0026] OMPI
    [0027] 、. WIPO た液体は.十 ラ ッ ブ 11で補集する。 濃縮器 3 を常 EEに戻し、 二方弁 15を開いて切断用試薬水溶液タ ン ク 16から所定量 の切靳用試薬水溶液を濃縮容器 3aに注入 し所定温度、 所 定時間濃縮容器 3aを加熱する と塩基選択的に切断された - DNAが得られる。
    [0028] 本発明に用いる吸着剤と しては、 陽イ オ ン または陰ィ オ ン交換体のいずれも使用出来、 ポ リ ス チ レ ン 樹脂を母 体とする もの、 あるいはセ ル ロ ー スを母体とする ものが 挙げられ、 例えば DoweX - X2、 Dowex - 50W (いずれも 商品名、 ダウ ケ ミ カ ル社製） 、 AIEC-CM52 、 AIEC- DE52 (いずれも商品名、 ヮ ッ ト マン 社製） などが使用 出来る。 また非イ オ ン 性の多孔質樹脂、 例えば
    [0029] Amb e r 1 i t e XAD - 2 (商品名、 ロ ー ム ア ン ドハー ス社製） 、 ダイ ヤイ オ ン HP - 10 (商品名、 三菱化成製） 、 レバチ ッ ト OC1031 (商品名、 バ イ エ ル社製） なども使用出来る。 更には逆相分配形に処理した細粒、 例えば高速液体ク α マ 卜 グラ フ ィ 一で使用される充塡剤でマイ ク ロ ボン ダパ ッ ク C 18 、 マ イ ク ロ ボ ン ダノヽ0 ッ ク CN 、 マ イ ク ロ ボ ン ダ パッ ク - フ エニ ー ル （いずれも商品名、 ゥ オ タ 一 ズ社製） などが使用される。
    [0030] 上記の吸着剤は、 通常ガ ラ ス 、 ス テ ン レ ス ス チ ー ル ま たはポ リ エチ レン 製のカ ラ ムに充塡して使用 し、 例えば セ ッ プパッ ク C - 18 (商品名、 ゥ オ タ ーズ社製） ある い はボ ン ド.エ ル ー 卜 C - 18 (ア ナ リ チ ケ ム - イ ン タ 一 ナ シ ョ ナ ル社製） はカ ラ ムに充塡 した状態で市販されてお り 好適に使用出来る。
    [0031] 吸着剤に保持された.該 D NAの溶出のための溶 出液には 吸着剤がィ オ ン 交換体の場合は酸性または塩基性物質の 水溶液が適用され特に アン モニヤ、 ピぺ ラ ジ ン などの揮 発性塩基性物質の水溶液が好適である。 吸着剤が非ィ ォ ン 交換性の多孔質澍脂および逆相分配形に処理 した細粒 の場合は、 メ タ ノ ー ル 、 エ タ ノ ー ルあるいはァ セ ト ニ 卜 リ ル などの揮発性の水溶性有機溶媒と水との混合溶液が 使用される。
    [0032] 反応容器は水浴、 ヒ ー タ — ブ口 ッ ク などで所定温度に 保持されるよ う に しておき、 放射性 リ ン で汚染されるた めに分析ごとに廃棄しなければな ら ない点を考慮 してデ ス ポ ゥザブルな容器、 例えばエ ツ ペ ン ド ル フ チュー ブ
    [0033] 38 10 (商品名、 エ ツ ペ ン ド ル フ社製） が好適に使用出
    [0034] ζ> Q
    [0035] 移液ポン プはテ フ ロ ン またはシ リ コ ン チュー ブを介 し て反応容器内の試料溶液を吸着器に送り 込むためのもの であ り 、 デッ ド ス ペ ー ス の少 く ない チュ一 ブポ ン プが使 用出来る。 濃縮器は上記吸着剤から溶出 した該 D NA溶液 を収容する合成樹脂または ガ ラ ス製の容器を収容し、 一
    [0036] 定温度に保持出来るよ う に温度調節機搆を設え、 減圧出
    [0037] ΟΜΡΙ
    [0038] 、： ATI0¾> 来る よ う-に密閉可能であ り 、 排気装置に連絡する搆造が 望ま しい。 また減圧下で濃縮を円滑に行う ために上記容 器を回転、 公転、 才差、 あるいは振動運動を与える機構 を設ける.と、 より都合が良い。
    [0039] 吸着剤に付着している 化学修飾試薬を洗浄除去する洗 浄液と しては、 吸着剤が陽イ オ ン または陰イ オ ン 交換体 の場合は純水が、 非イ オ ン 性の多孔質樹脂、 または逆相 分配形に処理した細粒の場合は純水または 1 0 9 &以下の 水溶性.有機溶媒水溶液が使用される。
    [0040] 本発明の方法即ち本発明の装置の違転の一連の操作は 多重時定数発振機を使用する こ とによ り 自動的に遂行す る こ とは容易であり 、 また濃縮器 3 に容器 3aを 4個収容 し、 反応容器、 吸着器等を 4組並列に配置する こ とによ り該 DNAの 4種の塩基選択的切断処理を同時に遂行する こと も可能で-ある o 本発明方法乃至装置は従来の方法に 比較 して高価な深冷々 凍機や高速遠心機を要せず簡潔な 搆造であ り 、 安価に 自動化が可能な装置であ り 、 本発明 の装置を用いて他の生化学物質の化学的処理、 例えば蛋 白質の酵素分解液の処理あるいは微量希薄 tJ質の濃縮、 例えば河川の 7j<中の晨薬分析の前処理などにも広く 応用 する こ と も 出来る。
    [0041] 実施例
    [0042] 合成 リ ン 力 一 " ( δ' - C - C - a - G - A - T - C - C - G -
    [0043] OMPI G - 3 ' ·) .· ( 日本ゼオ ン 社製カ タ ロ グ Not L - 100 3 ) を文献 (蛋白質核酸酵素第 2 3 巻 1 8 2 頁 1 9 7 8年） に準じて 放射性 リ ン で標識化したのち 4 本のエ ツ ペ ン ド ル フ チュ — ブ （ 2 入り 、 エ ツ ペ ン ド ル フ社製） に各々 約 5 0 万 カ ウ ン 卜 宛分注 し化学修飾反応を行ない反応停止液を加 え更に純水 1 ^を加えて第 1 Sの装置の反応器 1 にセ ッ 卜 した。 移液ポン プ 4 (チュー ブポン プ、 1 /分） を 作動 して反応液を吸着器 2 (吸着剤セ ッ プパッ ク C - 18 、 ゥ オ タ —ズ社製） に通過させ、 次いで純水 2 で洗浄 し た。 溶出液 （ 4 0 %エ タ ノ ー ル 水溶液） を同 じ く 移液ポ ン ブ 4を用いて吸着器 2 に通 し溶出液は三方弁 5 を濃縮 器 3 の方に開いて濃縮容器 3aに収容 した。 濃縮器 3を 9 0 Ό に加熱 し、 振動機 13、 真空ポ ン プ 12および減圧調節弁 14 を作動 して濃縮乾固 した。
    [0044] 次に切断用試薬水溶液タ ン ク 16 ( 0. 1 N -苛性ソーダ水 溶液入り） 力 ら 0. 0 2 の 0. 1 N -苛性ソ 一 ダ水溶液を二 方弁 15を開いて濃縮容器 3aに入れ、 9 0 TC 3 0 分加熱 し て切断処理を終えた。 次いで 7 M - 尿素 - 2 0 % ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲル で電気泳動および ォ 一 卜 ラ ジ オ グ ラ フ ィ 一を行なった。 結果を第 2 図に示す。 こ のォ— ト ラ ジ ォグラ フから被験試料の塩基配列を正確に解析する こ と が出来る。 尚、 第 2 図に於ける最右側の太いマー クは、 処理前の被:験試料についてのォ一 卜 ラ ジォ ダラ フである 。
    [0045]
    权利要求:
    Claims -- 請 求 の 範 囲
    1. デォキシ リ ボ核酸の化学修飾反応の終った反応液か ら 、 化学修飾されたデォキシ リ ボ核酸を分離 し、 次い でそれに切断用試薬を加えて加熱する こ とによ り修飾 された塩基の位置でデォキシ リ ボ核酸鎖を切断する デ ォキシ リ ボ核酸の切断処理方法において、 化学修飾反 応の終った反応液を吸着剤と接触させて該吸着剤に化 学修飾されたデォキシ リ ボ核酸を吸着させ、 該吸着剤 を洗浄液で洗浄して付着している化学修飾試薬を除去 した後、 溶出液と接触させて吸着されていた化学修飾 されたデォキシ リ ボ核酸を溶出せしめ、 該溶出液を濃 縮する ことによ り該分雜操作を行な う ことを特徵とす る デォキシ リ ボ核酸の切断処理方法。
    2. 化学修飾反応の終ったデォキシ リ ボ核酸の反応液か ら 、 化学修飾されたデォキシ リ ボ核酸を分離 し、 次い でそれに切断用試薬を加えて加熱する こ とによ り修飾 された塩基の位置でデォキ シ リ ボ核酸鎖を切断するた めの装置において、 K装置が該反応液を収容する反応 器、 移液ポ ン プ、 該化学修飾されたデォキシ リ ボ核酸 を吸着保持する吸着器、 三方弁および濃縮器を含んで いて、 且これらが上記の順に輸送管によって相互に連 結されている ことを特徵とする デォキ シ リ ボ核酸の切 断処理装置。
    OMPI
    3. 該'吸着器がイ オ ン交換体、 非イ オ ン 性多孔質樹脂お よび逆相分配形に処理 した細粒から成る群から選ばれ た吸着剤を充塡 したものである特許請求の範囲第 2 項 記載の装置 ο
    4. 該濃縮器が濃縮容器を任意の温度およ.び減圧状態に 調節 し、 かつ該容器を回転、 公転、. 才差あるいは振動 運動出来る よ う に したものである特許請求の範囲第 2 項記載の装置 o
    5. 該反 ¾器および該濃縮器の容器、 および該吸着器の
    吸着剤を交換自在に した特許請求の範囲第 2 項記載の
    O PI
    、 WIPO TIO^
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    ES2301581T3|2008-07-01|Aislamiento de acidos nucleicos.
    EP1570043B1|2013-07-24|Device and method for in-line blood testing using biochips
    Travis et al.1973|Selective removal of albumin from plasma by affinity chromatography
    RU2377571C2|2009-12-27|Детекторное устройство с использованием картриджа
    Hirs1967|[6] Determination of cystine as cysteic acid
    DE60031244T2|2007-05-24|Reinigung von biologischen substanzen
    US7736480B2|2010-06-15|Multi-dimensional electrophoresis method
    AU2004267536C1|2008-12-11|Apparatus for processing a fluid sample
    CA1338207C|1996-04-02|Method of assaying of nucleic acids, a reagent combination and kit therefore
    DE102004021822B3|2005-11-17|Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien
    ES2535809T3|2015-05-18|Métodos para aislar ácidos nucleicos
    ES2642862T3|2017-11-20|Aislamiento de biomoléculas
    EP0933132B1|2005-12-28|Nucleic Acid Extraction Apparatus
    CA1095896A|1981-02-17|Peptide or protein sequencing method and apparatus
    JP3989964B2|2007-10-10|統合マイクロフルイディック素子
    JP5318110B2|2013-10-16|サンプル調製装置
    EP0239600B1|1993-06-02|Apparatus for, and methods of, operating upon a fluid
    CA2580442C|2012-12-04|Device for analyzing samples
    Economou2005|Sequential-injection analysis |: a useful tool for on-line sample-handling and pre-treatment
    EP0824689B1|2004-06-30|Apparatus and method for electrophoresis
    Tsuda et al.1983|Separation of nucleotides by high-voltage capillary electrophoresis.
    EP1625229B1|2009-04-15|Method and device for removal of organic molecules from biological mixtures
    US3666854A|1972-05-30|Test for thyroid hormone
    Tamura et al.1967|Three naturally-occurring inhibitors of components of complement in guinea pig and rabbit serum
    Brawerman1974|[56] The isolation of messenger RNA from mammalian cells
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JPS59161398A|1984-09-12|
    US5106585A|1992-04-21|
    GB2146339A|1985-04-17|
    GB8427461D0|1984-12-05|
    JPS6241679B2|1987-09-03|
    EP0143849B1|1991-08-07|
    DE3490085T1|1985-04-04|
    DE3490085T0||
    EP0143849A1|1985-06-12|
    GB2146339B|1986-09-24|
    EP0143849A4|1988-04-26|
    DE3490085C2|1985-12-04|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1984-09-13| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): FR |
    1984-09-13| AK| Designated states|Designated state(s): DE GB US |
    1984-10-30| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1984901004 Country of ref document: EP |
    1985-04-04| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 3490085 Country of ref document: DE |
    1985-04-04| RET| De translation (de og part 6b)|Ref document number: 3490085 Country of ref document: DE Date of ref document: 19850404 |
    1985-06-12| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1984901004 Country of ref document: EP |
    1991-08-07| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1984901004 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP3297083A|JPS6241679B2|1983-03-02|1983-03-02||DE19843490085| DE3490085C2|1983-03-02|1984-03-01|Verfahren und Vorrichtung zum Spalten von Desoxyribonucleins{ure|
    GB08427461A| GB2146339B|1983-03-02|1984-03-01|Process and apparatus for scission treatment of deoxyribonucleic acid|
    [返回顶部]